自KarnyMullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以來，PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用*多、應(yīng)用*廣泛的手段之一，而引物設(shè)計(jì)也被認(rèn)為是 PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。 引物設(shè)計(jì)有 3條基本原則：引物與模板的序列要嚴(yán)格互補(bǔ)；兩條引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
在引物的設(shè)計(jì)過程中，引物長(zhǎng)度、產(chǎn)物長(zhǎng)度、序列 Tm值、引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性、形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation andhairpin）的能值、錯(cuò)配位點(diǎn)（false priming site）的引發(fā)效率、引物及產(chǎn)物的GC含量（composition）等均會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)效率產(chǎn)生影響，因此引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下幾個(gè)原則：
1. 引物的長(zhǎng)度一般為 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不應(yīng)大于38bp，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
2. 引物序列在模板內(nèi)（尤其是 3’端）應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物 3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如 GGG或 CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率增加。
3. 引物 3’端的末位堿基對(duì) Taq 酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為 A 的錯(cuò)配效率明顯高于其它 3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的 3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致 PCR反
應(yīng)失敗。5’端序列對(duì) PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。
4. 引物序列的 GC 含量一般為 40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的 Tm值在 72℃左右可使復(fù)性條件*佳。Tm值的計(jì)算有多種
方法， 如按公式 Tm＝4(G+C)＋2(A+T)， 在 Oligo軟件中使用的是*鄰近法。
6. ?G 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定
性。應(yīng)當(dāng)選用 3’端 ?G 值較低（**值不超過 9） ，而 5’端和中間 ?G 值相對(duì)較高的引
物。引物的 3’端的 ?G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā) DNA 聚合反應(yīng)。
7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過 4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且
降低引物有效濃度會(huì)使 PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。
8. 對(duì)引物的修飾一般是在 5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)載體的相應(yīng)序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的 PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。